Sorge nel complesso della Scala Santa, alla fine delle scale alle cui pareti sono affreschi raffigurantiStorie dell'Antico Testamento e Storie di cristo di diversi pittori, tra i quali Giovanni Baglione, Paolo Brill e Paris Nogari. E' detta anche Sancta Sanctorum, nome che rievoca quello assegnato agli ebrei alla parte del tempio di Gerusalemme dove era custodita l'Arca Santa, e che gli fu dato perchè in essa erano custodite le più preziose reliquie cristiane. Tra l'altro, il prepuzio di Gesù Bambino, i suoi sandali, il divano su cui assistette all'ultima cena, alcune pietruzze della colonna alla quale fu legato e flagellato, la canna con cui fu percosso il suo capo coronato di spine, una di queste spine, parte della spugna che piena d'aceto e fiele gli fu offerta mentre era in croce, le teste di S. Pietro e S. Paolo. Di tutte queste reliquie alcune sono scomparse, come il prepuzio di Gesù, rubato, secondo la tradizione, da un lanzichenecco e, chissà come, finito a Calcata nella parrocchia dei Santi Cornelio e Cipriano, dove fu oggetto di venerazione fino a quando, nel 1985, scomparve misteriosamente. Le teste dei santi Pietro e Paolo sono venerate nella basilica di S. Giovanni. le reliquie rimaste sono tenute coperte in 28 tabernacoli ogivali. Sull'altare, protetta da sportelli quasi sempre chiusi, l'immagine acheropita, cioè non dipinta da mano umana, del Redentore. Sopra l'altare è l'iscrizione "Non est in toto sanctior orbe locus"(Non esiste al mondo luogo più santo di questo). Gli affreschi sulla volta e nelle lunette sono del XIII secolo, mentre i santi entro le edicole ogivali sono di Giannicola di Paola.